Бактеріологічний метод діагностики мета етапи. Бактеріологічні методи
Культуральний (бактеріологічний) метод дослідження – сукупність способів, спрямованих на виділення та ідентифікацію чистих культур мікроорганізмів (бактерій) за допомогою культивування на живильних середовищах.
Чиста культура – сукупність мікроорганізмів одного виду. Найчастіше чисту культуру отримують шляхом відбору та культивування ізольованої колонії (нащадок однієї мікробної клітини).
Етапи методу:
1. Забір матеріалу на дослідження.
2. Виділення чистої культури та її ідентифікація.
3. Висновок.
Забір матеріалу на дослідження.Вид досліджуваного матеріалу залежить від мети дослідження (діагностика – від хворого; епіданаліз – із зовнішнього середовища, продуктів харчування, хворого та (або) бактеріоносія).
Виділення чистої культури. Включає 3 або 4 етапи:
1. Посів матеріалу (після попередньої мікроскопії) на чашку з щільним живильним середовищем (краще диференційно-діагностичним або селективним) з метою отримання ізольованих колоній. Виробляють його найчастіше методом механічного роз'єднання. У деяких випадках (наприклад, кров) матеріал попередньо засівають у рідке середовище збагачення з наступним пересіванням на чашку з агаровим середовищем. Іноді до посіву проводять селективну обробку матеріалу (з урахуванням властивостей мікроорганізму, що виділяється; наприклад, обробка кислотою або лугом для виділення стійких бактерій). Культивують при температурі 37°С протягом 18-24 годин. Час культивування для різних видів бактерій може коливатися.
2(3):а) вивчення колоній на чашці з агаром (культуральні ознаки), відбір найбільш типових; б) приготування мазків із цих колоній із забарвленням (за Грамом або іншими методами); а) відсівання залишку дослідженої колонії на середовище накопичення та вирощування в термостаті за оптимальної температури.
3(4). Вивчення чистоти культури, отриманої серед накопичення. З цією
метою готують мазок, фарбують (частіше за Грамом), мікроскопічно вивчають
морфологічну та тинкторіальну однорідність (у різних полях зору).
4(5). Ідентифікація чистої культури.
Висновок.За сукупністю ознак у порівнянні з властивостями еталонних (типових) штамів вказується вид виділеного із матеріалу мікроорганізму.
Оцінка методу:
переваги:відносно висока чутливість та точність, можливість визначити чисельність мікробів у досліджуваному матеріалі, а також чутливість до антибіотиків; недоліки:відносна тривалість, метод дорогий.
21. Поживні середовища для аеробів та анаеробів. Вимоги до поживних середовищ, класифікація.
Вимоги:
1. середовища повинні бути поживними
2. повинні мати певні ph
3. мають бути ізотонічними, тобто. осмотичний тиск у середовищі повинен бути такий самий як у клітці.
4. повинні бути вологими і не надто рідкими
5. повинні облпдпть певним окисно-відновним потенціалом
6. повинні бути стерильними
7. мають бути уніфікованими, тобто. містити постійні кількості окремих інгредієнтів.
Поживні середовища можна поділити:
А) За походженням:
1) природні – натуральні продукти харчування (м'ясо, молоко, картопля);
2) штучні - приготовані спеціально для вирощування мікробів: - середовища з природних продуктів (м'ясна вода, м'ясопептонний бульйон (МПБ), м'ясопептонний агар (МПА), - які не мають постійного складу; - синтетичні живильні середовища - розчини строго певних кількостей солей, амінокислот, азотистих основ, вітамінів у дистильованій воді - мають постійний склад, що використовуються для вирощування мікроорганізмів та культур клітин при отриманні вакцин, імунних сироваток та антибіотиків;
Б) За призначенням:
1) загального призначення (МПБ, МПА) – ними зростає більшість мікробів;
2) елективні - вибірково сприяють зростанню одного виду мікробів із суміші (наприклад, жовтково-сольовий агар для стафілококів);
ТЕМА: Стерилізація, асептика, антисептика, дезинфекція.
Принципи, методи культивування мікроорганізмів та виділення чистих культур.
Бактеріологічний метод дослідження. 1 етап.
1. Ознайомитися з основними методами дезінфекції та стерилізації, що застосовуються у мікробіології та медицині.
2. Знати особливості метаболізму мікроорганізмів, принципи їхнього культивування в лабораторних умовах.
3. Опанувати 1 етап бактеріологічного методу діагностики інфекційних захворювань.
1. Методи, прилади та режими стерилізації живильних середовищ, лабораторного посуду, медичного інструментарію.
2. Основні групи дезінфектантів, механізм їх дії, область та спосіб застосування.
3. Призначення живильних середовищ у мікробіологічній практиці.
4. Принцип отримання чистих культур мікроорганізмів та сутність бактеріологічного методу як «золотого стандарту» у діагностиці інфекційних захворювань.
5. Мета та послідовність виконання 1 етапу бактеріологічного методу виділення чистих культур мікроорганізмів.
1. Вибрати засоби, режим стерилізації та дезінфекції відповідно до конкретних завдань.
2. Охарактеризувати запропоновані живильні середовища, що застосовуються у мікробіологічній практиці.
3. Провести 1 етап бактеріологічного методу виділення чистих культур аеробних мікроорганізмів.
Контрольні питання:
1. Бактеріостатичну та бактерицидну дію низьких та високих температур на мікроорганізми.
2. Вплив хімічних речовин різних класів на мікроорганізми. Антисептики та дезінфектанти.
3. Поняття: стерилізація, дезинфекція, асептика, антисептика.
4. Методи, апаратура та режими стерилізації, їх вибір залежно від властивостей об'єкта, що стерилізується.
5. Основні групи дезінфектантів та тактика їх застосування у ЛПЗ.
6. Принципи та методи культивування мікроорганізмів.
7. Поживні середовища: поняття; вимоги до них; класифікація.
8. Поняття про вид, штам, колонію, чисту культуру мікроорганізмів.
9. Сутність бактеріологічного методу та сфери його застосування.
10. Мета та послідовність виконання 1 етапу бактеріологічного методу виділення аеробів.
Завдання, що виконуються під час заняття (УІРС):
1. Ознайомитись з приладами, що використовуються для стерилізації в медичній та мікробіологічній практиці: паровий стерилізатор (автоклав), піч Пастера.
2. Вибрати прилади та режими стерилізації живильних середовищ, лабораторного посуду, медичного інструментарію.
3. Ознайомитися з дезінфектантами, що використовуються у медичній та мікробіологічній практиці. Вибрати дезінфектанти та режим дезінфекції для пропонованих об'єктів.
4. Ознайомитись з різними поживними середовищами, що застосовуються у мікробіологічній практиці, дати їх характеристику за складом, консистенцією, призначенням.
5. Провести 1 етап бактеріологічного методу виділення чистих культур аеробів:
5.1. Приготувати фіксований препарат з досліджуваного матеріалу, пофарбувати за Грамом, промікроскопувати та провести ідентифікацію виявлених мікроорганізмів за морфологічними та тинкторіальними властивостями.
5.2. Посіяти досліджуваний матеріал методом «штрих із майданчиком».
5.3. Посіяти досліджуваний матеріал методом Дрігальського (демонстрація).
6. Ознайомитись із набором засобів для взяття та транспортування патологічних матеріалів.
Методичні вказівки до виконання дослідницького завдання:
1. Ознайомлення з приладами, що використовуються для стерилізації: паровий стерилізатор (автоклав), піч Пастера.
1.1. Паровий стерилізатор (автоклав) – стерилізація парою під тиском.
Найбільш надійним та універсальним методом стерилізації в медичній та мікробіологічній практиці є стерилізація парою під тиском. Виробляють її в автоклаві, в якому об'єкти, що стерилізуються, нагрівають насиченою парою під тиском вище атмосферного. Між показаннями манометра та температурою насиченої пари є наступна залежність:
Нульовим тиском вважають нормальний атмосферний тиск (760 мм рт. ст.).
Стерилізація досягається лише при повній справності автоклава та правильної його експлуатації спеціально навченим персоналом. Тому необхідний постійний контроль за режимом стерилізації, який проводиться фізичним (термометр максимальний та ін.), Біологічним (біотест зі спорами тест-культур мікроорганізмів) та хімічним (хімічні тести, індикатори типу ІС) способами.
Контроль режиму стерилізації автоклавів проводять хімічним способом під час кожного завантаження автоклава. Хімічний тест – скляна трубочка з хімічною речовиною, що має певну температуру плавлення: антипірин, резорцин – 110±1°, бензойна кислота – 120±2°, бензамід – 126±1°, сечовина, нікотинамід, Д(+)-манноза – 13 ±2°. До складу хімічних тестів вводять аніліновий барвник (фуксин, генціанвіолет та ін.), Який рівномірно забарвлює речовину при його розплавленні. В даний час найчастіше використовуються індикатори типу ІС (фірма «Вінар», Росія), що представляють смужку паперу з нанесеним на неї шаром індикаторної суміші та призначені для оперативного візуального контролю не тільки температури, а й часу стерилізації (ІС-120, ІС-132) . Щоквартально проводиться контроль режиму стерилізації з використанням біотесту зі спорами тест-культури Bacillus stearotermophilus BKM B-718
1.2. Пекти Пастера - стерилізація сухим жаром.
У печі Пастера стерилізують вироби зі скла, металів та гум на основі силіконового каучуку. Режим стерилізації: 160 ° С - 150 хв; 180 ° С - 60 хв. Контроль режиму стерилізації кожного циклу здійснюється за допомогою індикаторів стерилізації ІС-160, ІС-180; щоквартально – з використанням біотесту зі спорами тест-культури Bacillus licheniformisшт. G BKM B-1711
2. Заповнити вдоматаблицю №1.
Таблиця 1.
Стерилізація
3. Ознайомитись з дезінфектантами та заповнити на заняттітаблицю №2, використовуючи додатки №1, 2.
Таблиця 2.
Дезінфекція
4. Ознайомитися з живильними середовищами та заповнити на заняттітаблицю №3 «Поживні середовища».
Таблиця 3.
5. Клінічна мікробіологія як розділ медичної мікробіології вирішує дві основні завдання: етіологічну діагностику інфекційного захворювання та раціональний вибір засобів етіотропної терапії.
Основним методом мікробіологічної діагностики, що дозволяє вирішити ці завдання, є бактеріологічний метод. Суть бактеріологічного методу полягає у виділенні чистої культури збудника, визначення його виду та чутливості до антимікробних препаратів.
Вибір досліджуваного матеріалузалежить від виду захворювання та переважної локалізації збудника на певному етапі його розвитку (патогенезу). Матеріалом може служити кров, ліквор, ранове відділення, мокрота, випорожнення, сеча і т. д. Техніка забору матеріалу має велике значення для отримання достовірного результату.
Успіх виділення чистої культури визначається правильністю вибору живильного середовища та умов культивування. Універсального живильного середовища, використання якого дозволить виділити будь-які мікроорганізми з будь-якого досліджуваного матеріалу, не існує. Тому з урахуванням фізіологічних особливостей можливих збудників захворювання проводиться посів матеріалу на певне живильне середовище або комплекс поживних середовищ (спеціальні, елективні, диференціально-діагностичні). Для деяких мікроорганізмів потрібні й особливі умови культивування (анаеробні, мікроаерофільні, з підвищеним вмістом вуглекислоти).
Патологічний матеріал від хворого часто є сумішшю мікроорганізмів. У зв'язку з цим завданням є їх роз'єднання та отримання ізольованих колоній. Ізольована колонія, як результат розмноження однієї мікробної клітини і що складається з одного виду клітин, є основою отримання чистої культури. У мікробіологічній практиці використовують різноманітні методи отримання ізольованих колоній. Найчастіше використовуються такі:
1. Посів досліджуваного матеріалу методом «штрих із майданчиком»– досліджуваний матеріал наносять на поверхню щільного живильного середовища на обмеженій ділянці, а потім розподіляють шляхом посіву частими паралельними штрихами.
2. Метод Дрігальського- матеріал, внесений на першу чашку з живильним середовищем і посіяний за допомогою шпателя, послідовно засівають тим самим шпателем, не стерилізуючи його ще на 1-2 чашки.
3. Метод секторних посівів- Досліджуваний матеріал однією петлею засівають послідовно на кілька секторів. У цьому певна техніка посіву (метод Gould) дозволяє не тільки отримати ізольовані колонії, але й визначити кількість мікроорганізмів в 1 мл (г) досліджуваного матеріалу, що має значення в оцінці етіологічної ролі умовно-патогенних мікроорганізмів (УПМ).
5.1.Проведення 1 етапу бактеріологічного методу виділення аеробів:
· з досліджуваного матеріалу приготуйте фіксований препарат, пофарбуйте за методом Грама, промікроскопуйте, проведіть ідентифікацію виявлених мікроорганізмів за морфо-тинкторіальними властивостями; Зверніть увагу на кількість мікроорганізмів. Результати занесіть у протокол та зробіть висновок;
· посійте досліджуваний матеріал на половину чашки із щільним живильним середовищем методом «штрих із майданчиком»;
· посійте досліджуваний матеріал на три чашки з живильним середовищем методом Дрігальського (демонстрація);
· підпишіть чашки, вказавши дату посіву, і поставте їх вгору дном у термостат за нормальної температури 37° на 18-24 год.
6. Засоби для взяття та доставки патологічного матеріалу
Примітка: * - використовують у разі, якщо терміни доставки матеріалу до лабораторії після отримання перевищують 1,5-2 год.
Питання для самоконтролю:
1. Назвіть та обґрунтуйте принципи культивування мікроорганізмів.
2. Чому при сівбі патологічного матеріалу використовуються елективні, диференціально-діагностичні середовища та середовища накопичення.
3. Обґрунтуйте принцип отримання чистих культур мікроорганізмів.
4. Чому бактеріологічний метод є «золотим стандартом» у мікробіологічній діагностиці інфекційних захворювань?
5. На чому ґрунтуються хімічні та біологічні способи отримання чистих культур мікроорганізмів?
6. У чому полягає відмінність стерилізації від дезінфекції?
7. Обґрунтуйте призначення стерилізації та дезінфекції у мікробіологічній та медичній практиці.
8. Обґрунтуйте перевагу використання термоіндикаторних систем під час контролю режиму стерилізації (на прикладі індикатора ІС фірми «Вінар», Росія).
Література:
Підручники:
1. Борисов Л. Б. Медична мікробіологія, вірусологія, імунологія. - М.: ТОВ «МІА», 2002. - С. 26-29, 63-66, 150-159.
2. Поздєєв О. К. Медична мікробіологія / За ред. акад. РАМН В. І. Покровського. - М: ГЕОТАР Медицина, 2001. - С. 76-77, 126-130, 253-265.
Додаткова література:
1. Безпека роботи з мікроорганізмами III – IV груп патогенності та гельмінтами: Санітарні правила. - М.: Федеральний центр держсанепіднагляду МОЗ Росії, 1999. - 107с.
Лекції з мікробіології.
Тести.
Бактеріологічний (культуральний) метод
сукупність методик штучного культивування мікроорганізмів на живильних середовищах з метою їх ідентифікації при встановленні д-за інфекційного захворювання або іншого викликаного мікробами процесу та визначення низки фізіологічних св-в к-ри з ін. цілями, напр., при виборі хіміотерапевтичного препарату. Сучасні методи вивчення більшості біол. св-в бактерій можливі лише за наявності чистої к-ри(Див.). Контамінація к-ри ін. видом мікробів, як правило, веде до спотворення результатів та неправильного висновку. Тому перше завдання Б.м. є отримання чистої к-ри будь-якого виду (вара) з мікробної асоціації та попередження контамінації сторонньою мікрофлорою матеріалу для дослідження та мікробної к-ри на всіх етапах дослідження. Це можливо при заборі матеріалу в стерильних умовах у стерильний посуд, посіві матеріалу в стерильні середовища стерильним інструментом, попередження попадання мікробів з повітря в процесі доставки, зберігання та інкубації матеріалу та засіяних поживних середовищ. Друге завдання Б.М. - ідентифікація мікробів(див.) виділеної чистої к-ри, третя - визначення додаткових св-в, напр., чутливості до антибіотиків, вірулентності. Етапи Б.м.: 1) забір матеріалу (див. Матеріали для дослідження)та його доставка у бактеріол. лабораторію; 2) мікроскопія ісл. матеріалу (див. Бактеріоскопічний метод).Цей етап часто не виконується, хоча, незважаючи на меншу чутливість, попередня мікроскопія в ряді випадківдає орієнтовні відомості про збудник і дозволяє вибрати необхідні посіву середовища; 3) обробка досл. матеріалу фіз. чи хім. факторами з метою видалення чи зменшення сторонньої мікрофлори. Ця міра застосовується, напр., при дослідженні мокротиння, виділенні кислотостійких та спороутворюючих мікробів; 4) посів ісл. матеріалу (див. Посіви бактеріологічні)на живильні середовища для одержання ізольованих колоній; 5) інкубація засіяних поживних середовищ. Терміни і температура інкубації залежить від передбачуваної видової приналежності к-ры. Зазвичай посіви витримують термостаті при 37°С 1-2 дні. Якщо зростання відсутнє, термін інкубації може бути продовжено ще на 2 – 3 дні. При більш тривалій інкубації необхідно запобігти висиханню середовища, для чого посіви поміщають в ексикатор з водою або пробки пробірок заливають парафіном; 6) дослідження колоній(Див.). Для вивчення вибирають однорідні ізольовані колонії, що розташовуються далеко від країв чашки і штрихом петлі, оточують їх рисою, нумерують. Якщо дослідження ведеться ненаправлено (поліетиологічний процес та ін.), то на підставі результатів візуального огляду вибирають по 2 - 3 колонії всіх наявних на чашці типів та роблять з них мазки; 7) пересівання з вибраних колоній на середовище накопичення. Для цього з залишку колонії, в мазку до-рой виявлені однорідні за формою та забарвленням бактерії, петлею, намагаючись не зачепити сусідні колонії, забирають частину к-ри і засівають на скошений в пробірці МПА або спеціальне середовище штрихом; 8) інкубація посівів у термостаті до появи суцільного зростання (зазвичай 1-2 дні); 9) визначення чистоти виросла на скошених середовищах к-ри шляхом макроскопічного огляду зростання та мікроскопії мазка з нього; 10) ідентифікація виділеної чистої к-ри і у разі потреби (на вимогу клініциста, епідеміолога) визначення різних біол. св-в; 11) висновок про видову приналежність виділеної к-ри та її св-вах. Висновок дається на офіційному бланку з посиланням на номер, під крим ця к-ра занесена до лабораторного журналу. Б.М. є основним у д-ці більшості бактер. інфекцій. Він, як правило, має високу чутливість, що дозволяє виділити з, ісл. матеріалу чисту к-ру, навіть якщо в посівній дозі матеріалу містилося кілька десятків особин. Для Б.М. характерна висока специфічність. Виділення тієї чи іншої виду бактерій з патологічного матеріалу за дотримання низки умов (див. Збудник хвороби)надійно встановлює етіологію патологічного процесу. Виняток становлять умовно-патогенні аутохтонні для того чи іншого біотопу бактерії для визначення етіол. ролі яких брало потрібні спеціальні критерії, а також розмежування носійства і захворювання (напр., дифтерійне носійство при стрептококовій ангіні). Цінність Б.м. полягає також у тому, що з його допомогою можуть бути встановлені св-ва к-ри, необхідні для призначення хіміо- та серотерапії, виявлення джерела інфекції та механізмів передачі збудника, вибору протиепідемічних заходів. Зрештою, Б.м. відноситься до ранніх методів д-ки. Недоліки Б. м. – небезпека інфікування, складність, трудомісткість, тривалість. Достовірні дані про склад мікрофлори та її св-вах можна отримати тільки при дослідженні вибірки з 3-10 к-р.
Дослідження бактерій має велике практичного значення для людини. На сьогоднішній день відкрито велику кількість прокаріотів, які відрізняються один від одного за патогенністю, областю поширення, формою, розмірами, кількістю джгутиків та іншими параметрами. Щоб детально вивчити цей штам, застосовується бактеріологічний метод дослідження.
Які методи клітин?
Щоб визначити, чи є патогенними бактерії, проводять дослідження культури різними способами. Серед них:
1. Бактеріоскопічний метод.
2. Бактеріологічний метод.
3. Біологічний спосіб.
Бактеріоскопічний та бактеріологічний засновані безпосередньо на роботі з клітинами прокаріотів, коли біологічний аналіз потрібен для вивчення впливу таких клітин на живий організм піддослідних тварин. За ступенем прояву тих чи інших ознак захворювання вчений може зробити висновок про наявність або відсутність патогенних бактерій у пробі, а також природно їх розмножити в організмі тварини для їхньої культури та використання в інших роботах.
Бактеріологічний метод дослідження відрізняється від бактеріоскопічного. У першому для аналізу використовується спеціально підготовлена культура живих прокаріотів, коли у другому проводиться робота з мертвими або живими клітинами на предметному склі.
Етапи бактеріологічного методу дослідження. Мікробіологія
Принцип вивчення властивостей бактеріальної культури може стати в нагоді як для вчених-мікробіологів, які поставили за мету досліджувати прокаріотичні клітини, так і для лаборантів, завдання яких полягає у встановленні патогенності або непатогенності бактерій, а потім діагнозу пацієнта.
Методика вивчення бактерій поділяється на три етапи:
1. Виділення бактерій із первісної проби.
2. Висівання бактерій та вирощування вивчення її властивостей.
Перший етап
Проба або мазок береться з вільної поверхні середовища або у пацієнта. Таким чином ми отримуємо «коктейль» з багатьох видів бактерій, які повинні висіяти на живильне середовище. Іноді з'являється можливість виділити одразу необхідні бактерії, знаючи їх осередки розповсюдження в організмі.
Через дві-три доби відбираються потрібні колонії і висіваються на тверді середовища чашок Петрі за допомогою стерильної петлі. У багатьох лабораторій працюють із пробірками, де може бути тверда чи рідка живильне середовище. Так і проводиться бактеріологічний метод дослідження мікробіології.
Другий етап
Після отримання окремих колоній бактерій проводиться безпосередній макро- та мікроаналіз. Вимірюються всі параметри колоній, визначається колір та форма кожної з них. Нерідко проводиться підрахунок колоній на чашці Петрі, та був у вихідному матеріалі. Це має значення при аналізі патогенних бактерій, від яких залежить ступінь захворювання.
Бактеріологічний метод дослідження, 2 етап якого полягає у вивченні окремих колоній мікроорганізмів, може бути пов'язаний із біологічним способом аналізу бактерій. Ще одна мета роботи на цьому етапі – збільшити кількість вихідного матеріалу. Це можна зробити на живильному середовищі, а можна провести експеримент у природних умовах на живих піддослідних організмах. Патогенні бактерії будуть розмножуватися, і в результаті кров міститиме мільйони клітин прокаріотів. Зі взятої крові легко приготувати необхідний робочий матеріал бактерій.
Третій етап
Найважливіша частина дослідження – це визначення морфологічних, біохімічних, токсигенних та антигенних властивостей культури бактерій. Робота ведеться із заздалегідь «очищеними» культурами на живильному середовищі, а також із препаратами (часто забарвленими) під мікроскопом.
Встановити належність патогенних або умовно-патогенних бактерій до тієї чи іншої систематичної групи, а також визначити їхню стійкість до ліків дозволяє бактеріологічний метод дослідження. 3 етап – антибіотики, тобто. аналіз поведінки клітин бактерій в умовах вмісту лікарських препаратів у навколишньому середовищі.
Дослідження стійкості культури до антибіотика має важливе практичне значення, коли необхідно прописати для конкретного пацієнта необхідні, а головне дієві препарати. Тут може допомогти бактеріологічний метод дослідження.
Що таке живильне середовище?
Для розвитку та розмноження бактерії повинні знаходитись у заздалегідь підготовлених поживних середовищах. За консистенцією вони можуть бути рідкими або твердими, а за походженням - рослинними або тваринами.
Основні вимоги до живильних середовищ:
1. Стерильність.
2. Максимальна прозорість.
3. Оптимальні показники кислотності, активності води та інших біологічних величин.
Отримання ізольованих колоній
1. Метод Дрігальського. Він у тому, що у бактеріальну петлю наноситься мазок з різними видами мікроорганізмів. Цією петлею проводять по першій чашці Петрі з живильним середовищем. Далі, не змінюючи петлю, методом залишкового матеріалу проводять по другій та третій чашках Петрі. Так, на останніх зразках колонії бактерії засіватимуться не надто щільно, тим самим спрощується можливість знайти необхідні для роботи бактерії.
2. Метод Коха. У ньому використовуються пробірки з розплавленим живильним середовищем. Туди поміщається петля або піпетка з мазком бактерій, після чого вміст пробірки виливається на спеціальну пластинку. Агар (або желатин) застигає через якийсь час, а в його товщі легко виявити потрібні колонії клітин. Важливо перед початком роботи розвести суміш бактерій у пробірках, щоб концентрація мікроорганізмів була дуже великою.
Етапи якого засновані на виділенні необхідної культури мікробів, не обходиться без цих двох методів знаходження ізольованих колоній.
Антибіотикограма
Візуально реакцію бактерій на препарати можна помітити двома практичними способами:
1. Метод паперових дисків.
2. Розведення бактерій та антибіотика в рідинному середовищі.
Метод паперових дисків вимагає наявності культури мікроорганізмів, які були вирощені на твердому живильному середовищі. На таке середовище кладуть кілька папірців округлої форми, просочені антибіотиками. Якщо препарат успішно справляється з нейтралізацією бактеріальних клітин, після такої обробки залишиться ділянка, позбавлена колоній. Якщо реакція на антибіотик негативна, бактерії виживуть.
У разі використання рідкого живильного середовища спочатку готують кілька пробірок з культурою бактерій різних ступенів розведення. У ці пробірки додають антибіотики і протягом доби спостерігають за процесом взаємодії речовини та мікроорганізмів. Зрештою, виходить якісна антибіотикограма, за якою можна судити про ефективність препарату для даної культури.
Основні завдання аналізу
Тут перераховані за пунктами цілі та етапи бактеріологічного методу дослідження.
1. Отримати вихідний матеріал, який використовуватиметься виділення колоній бактерій. Це може бути мазок із поверхні будь-якого предмета, слизової оболонки або порожнини органу людини, аналіз крові.
2. на твердому живильному середовищі. Через 24-48 годин на чашці Петрі можна знайти колонії бактерій різних видів. Відбираємо за морфологічними та/або біохімічними критеріями потрібну і проводимо вже з нею подальшу роботу.
3. Розмноження набутої культури. Бактеріологічний метод дослідження може спиратися на механічний чи біологічний спосіб збільшення чисельності культури бактерії. У першому випадку ведеться робота з твердими або рідкими живильними середовищами, на яких у термостаті розмножуються бактерії та утворюють нові колонії. Біологічний спосіб вимагає природних умов збільшення чисельності бактерій, тому тут мікроорганізмами заражається піддослідна тварина. Через кілька діб у пробі крові або мазку можна виявити безліч прокаріотів.
4. Робота з чистою культурою. Щоб визначити систематичне положення бактерій, а також їхню приналежність до збудників захворювань, необхідно провести ретельний аналіз клітин за морфологічними та біохімічними ознаками. При дослідженні патогенних груп мікроорганізмів важливо знати, наскільки ефективною є дія антибіотиків.
То була загальна характеристика бактеріологічного методу дослідження.
Особливості проведення аналізу
Головне правило проведення бактеріологічного дослідження – це максимальна стерильність. Якщо йде робота з пробірками, посіви та пересівання бактерій повинні проводитися лише над нагрітим спиртуванням.
Усі етапи бактеріологічного методу дослідження вимагають використання спеціальної петлі чи пастерівської піпетки. Обидва інструменти мають бути попередньо оброблені в полум'ї спиртівки. Що стосується пастерівської піпетки, то перед термічною стерилізацією необхідно відламати кінчик піпетки пінцетом.
Техніка сівби бактерій теж має свої особливості. По-перше, при сівбі на тверді середовища проводять бактеріальну петлю по поверхні агару. Петля, звичайно, вже повинна мати на поверхні зразок мікроорганізмів. Також практикується посів усередину і в цьому випадку петля або піпетка повинні досягти дна чашки Петрі.
Під час роботи з рідкими середовищами використовуються пробірки. Тут важливо стежити, щоб рідини не торкалися країв лабораторного посуду або пробки, а використовувані інструменти (піпетка, петля) не торкалися сторонніх предметів та поверхонь.
Значення біологічного методу дослідження
Аналіз проби бактерій має своє практичне застосування. Насамперед бактеріологічний метод дослідження можна використовувати у медицині. Наприклад, необхідно вивчити мікрофлору хворого, щоб встановити правильний діагноз, і навіть виробити правильний перебіг лікування. Тут допомагає антибіотикограма, яка покаже активність лікарських засобів проти збудника захворювань.
Аналіз бактерій використовується в лабораторії для визначення таких небезпечних захворювань, як туберкульоз, тиф або гонорея. Також він застосовується для вивчення бактеріального складу мигдаликів, порожнин органів.
Бактеріологічний метод дослідження можна використовуватиме визначення забрудненості середовища. За даними про кількісний і якісний склад мазка з поверхні будь-якого предмета визначається ступінь заселеності даного середовища мікроорганізмами.
Суть методу – виділення чистої культури мікроба – збудника з патологічного матеріалу, докладне вивчення його морфологічних, тинкторіальних, культуральних, біохімічних, серологічних властивостей із метою подальшої ідентифікації збудника. При здійсненні бактеріологічного методу дослідження виділяють 4 етапи.
Враховуючи дані, отримані при бактеріоскопічному дослідженні, здійснюється вибір максимально ефективних поживних середовищ, на яких з найбільшою часткою ймовірності вдасться отримати зростання культури передбачуваних мікробів – збудників.
Б. Виробляється посів досліджуваного матеріалу на ряд поживних середовищ: рідких та щільних, універсальних, елективно-селективних, диференційно-діагностичних. При цьому посів на чашки Петрі із щільними живильними середовищами проводиться бактеріологічною петлею штрихом з метою забезпечити можливість отримання зростання ізольованих один від одного колоній мікробів (можна користуватися також способом дрігальського або іншим методом роз'єднання культур мікроорганізмів).
А. Вивчаються культуральні властивості вирослих на живильних середовищах мікроорганізмів; провадиться відбір підозрілих колоній. Слід наголосити, що відбір підозрілих колоній – найвідповідальніший і найважчий етап роботи. Він заснований насамперед на визначенні характерних особливостей колоній мікробів, але часто це не дозволяє диференціювати колонії мікробів окремих видів і доводиться додатково вивчати морфологію мікробів у мазках з підозрілих колоній, особливості зростання мікроорганізмів на диференціально-діагностичних середовищах тощо. Виділення чистих культур бактерій та його вивчення можна здійснювати, проводячи попередній посів на рідкі середовища накопичення, але за цьому витрачається додатковий час дослідження.
Б. З підозрілих колоній готується бактеріологічний мазок, забарвлюється за Грамом та мікроскопується (встановлюється ідентичність мікроорганізмів з вивченими при мікроскопічному дослідженні на 1-му етапі).
В. З частини підозрілої колонії проводиться пересівання культури на скошений м'ясо-пептонний агар (можна використовувати й інші поживні середовища, на яких передбачається хороше зростання виділених мікроорганізмів). Ціль, накопичення чистої культури мікроба – передбачуваного збудника захворювання, т.к. на наступному етапі дослідження знадобиться багато мікробної маси.
У передбачуваного збудника вивчаються цукролітичні властивості (виробляється посів на середовищі строкатого ряду середовища Олькеницького, Ресселя та ін.), протеолітична активність (посів на желатин, молоко по Тукаєву, визначення утворення індолу та сірководню при зростанні на м'ясо-пептонному бульйоні). Досліджується чутливість виділених культур до антибіотиків (частіше методом стандартних паперових дисків, рідше – методом серійних розведень). Виробляється серотипування в реакції аглютинації на склі з груповими та типовими діагностичними сироватками; фаготипування зі стандартними діагностичними бактеріофагами Для ідентифікації деяких випадках вивчаються чинники патогенності у бактерій.
Здійснюється облік результатів проведених досліджень. З порівняння виявлених у мікроорганізмів якостей (морфологічних, тинкторіальних, культуральних, біохімічних, серологічних тощо.) здійснюється ідентифікація бактерій. Видається остаточна відповідь з результатами бактеріологічного дослідження, де вказується вид збудника (іноді – його серотип, біовар, фаготип) та його чутливість до антибіотиків.
Досить часто отримання достовірних результатів видачі відповіді передують, біологічний, алергологічний чи інші методи дослідження.
Переваги бактеріологічного методу діагностики : висока достовірність результатів дослідження; можливість отримання додаткових даних про чутливість виділених збудників до антибіотиків; можливість проведення епідеміологічних досліджень.
